产品与服务

• 类器官原位荧光缓冲液
  • 货号
    NGH050001-A
  • 规格 (1kit)
    125ml
  • 保质期
    2~8℃，1Year
• 类器官原位荧光通透液
  • 货号
    NGH050001-B
  • 规格 (1kit)
    250ml
  • 保质期
    2~8℃，2weeks，-20℃ for 1year
• 类器官原位荧光封闭液
  • 货号
    NGH050001-C
  • 规格 (1kit)
    250ml
  • 保质期
    2~8℃，1Year
• 类器官原位荧光清洗液
  • 货号
    NGH050001-D
  • 规格 (1kit)
    250ml
  • 保质期
    2~8℃，1Year
• 类器官原位荧光3D透明化试剂
  • 货号
    NGH050001-E
  • 规格 (1kit)
    10ml
  • 保质期
    2~8℃，1Year
• 类器官回收液
  • 货号
    NGH050001-F
  • 规格 (1kit)
    10ml
  • 保质期
    2~8℃，1Year

一．类器官回收（0rganoid Recovery from 3D Matrix）

1.预防类器官粘附：用1%PBS-BSA 预包被移液枪头和离心管，避免类器官损失。2.去除培养基并清洗：吸去培养基，用1mlPBS轻柔清洗孔板，清洗完毕后将1ml

枪头减去头部吸取适量 PBS 冲打目标胶滴至完全脱落，移至EP管。残留部分加入适量冰冷的细胞回收液至基质胶完全溶解后，移至EP管，再用PBS清洗板孔。4°C低速离心。

解离 3D 基质： 加入 10倍基质胶体积的冰冷细胞回收溶液，4°C水平摇床 60rpm，孵育 1-2h，直至 3D 基质完全溶解。

去除基质残留:4°C低速离心3分钟，去除上清液。

注意事项:完全去除 3D基质对于后续免疫标记至关重要，残留的基质可能影响抗体渗透，导致染色不均匀或高背景信号。

二.固定、通透与封闭（Fixation and Blocking）

1.固定：用3ml 4% PFA 重悬类器官，并确保完整覆盖。在 4°C孵育 45 分钟固定，中途轻轻重悬一次以确保均匀固定。

2清洗:加入冷类器官原位荧光清洗液，4°C清洗2次，每次静置10分钟，4°C低速离心离心5分钟。

3.通透：重悬于 1ml 类器官原位荧光通透液透化，4°C轻摇30min。

4.封闭:加入 1ml 类器官原位荧光封闭液，轻柔混匀，4°C 轻摇 15 分钟。

三.免疫标记（Immunolabeling）

1.加入一抗：4°C过夜孵育（60 rpm 轻柔摇晃）。

2. 0WB洗涤：每孔加入适量类器官原位荧光缓冲液（0WB），轻摇洗涤2小时，4°C低速离心，去上清。重复 3 次。

3.加入荧光二抗：室温孵育 1h 或者4°c过夜孵育。-

4.洗涤：加入适量冷类器官原位荧光清洗液，4°C轻柔摇晃10min。重复洗涤2次。确保去除未结合的二抗。4°C，低速离心3min，去除上清。

注意:洗去游离荧光二抗，避免干扰

5. DAPI /PI 染色。

6.洗涤：加入适量冷类器官原位荧光清洗液，4°C轻柔摇晃10min。重复洗涤2次。

7.透明化处理:加入类器官原位荧光透化液(至少50ul)，轻柔重悬，室温孵育20min，避免气泡形成。

8琼脂糖固定:透明化处理后加入与类器官原位荧光透化液等体积的4%低熔点的琼脂糖溶液混匀。(可选做)

9,载玻片制备:载玻片上贴上孔贴纸形成成像区域,防止样本扩散。(可以叠加 1-3 层,具体取决于类器官大小)。或者用凹载玻片。

10.转移类器官:剪去200uL 移液枪头的末端，取 20 L透明化后的类器官溶液,滴加孔贴纸圆孔区域(如果样木较大,可按每层孔贴纸 15uL的比例叠加多个层次)

11.覆盖盖玻片封片:孔贴纸两侧刷上两滴指甲油(薄薄少量)将盖玻片一侧先贴在上,然后缓慢放下另一侧，避免产生气泡。这样可以封闭样本，同时保证盖玻片不会压碎类器官。

12.等待样本均匀扩散:静置1分钟，让透明化溶液充分扩散到盖玻片下的空间。

13.成像:依据实验需求选择显微镜(共聚焦、双光子或光片显微镜)。设定合适的成像参数，进行 3D 成像。

14.数据分析:使用 Imaris、ImageJ 或 Arivis 进行图像处理。进行细胞分割、荧光信号定量分析。

四.注意事项:

确保透明化步骤充分进行，否则可能影响深层组织成像质量。

成像过程中避免光漂白，优化激光功率和曝光时间。

成像后尽快保存数据，进行后续分析。

免疫标记和样本转移过程中可能会有10-20%的类器官损失,建议温和移液并优化离心条件。

可暂停点:在 0WB(4℃)中可短期存放类器官(最多2天)，但建议尽快进行透明化处理。